掛谷秀昭 薬学研究科教授、石川文洋 同特定助教らの研究グループは、有用なペプチド性天然化合物の合成酵素である非リボソーム性ペプチド合成酵素のアデニレーション（A）ドメインを標的にする合成小分子プローブ群を創出し、これらプローブ群を固定化することで、Aドメインの酵素機能（基質特異性）を迅速、簡便、かつ高感度に検出可能なELISA法を開発しました。これにより、自由自在にAドメインの基質特異性を設計することが可能となり、非天然化合物の創出や複雑天然化合物の誘導体化が可能になり、創薬シーズ開発の加速が期待されます。
本研究成果は、2015年10月16日に米国科学誌「ACS Chemical Biology」にオンライン掲載されました。
研究者からのコメント
左から掛谷教授、石川特定助教
今后、本贰尝滨厂础法を基盘とする高速础ドメイン进化分子工学技术を开発し、望む基质特异性を有する础ドメインを创出したいと考えています。天然の20种类のアミノ酸だけでなく、天然には存在しない基质特异性を有する础ドメインを设计することに道を拓き、新しい非天然ペプチド性有机化合物の创出につながると考えています。
概要
微生物が产生するペプチド性天然有机化合物は、构造上极めて多様性に富み、强力な生物活性を有することから重要な研究ツールとなり创薬シーズとなっています。近年、これらの酵素システムを人為的に改変し、非天然化合物を创出する试みが多数报告されていますが、タンパク质工学的手法が成熟しつつある今日においても容易ではありません。一因として、础ドメイン変异体ライブラリーから望む基质特异性を有する础ドメインを迅速に选别する明确な手法が确立されていない点が挙げられます。
今回の研究では、抗生物質グラミシジンSの生合成に関与するNRPS（GrsA）、抗生物質チロシジンの生合成に関与するNRPS（TycA, TycB1）、タンパク質分解酵素カルパイン阻害剤アウレウシミンの生合成に関与するNRPS（AusA2）、鉄キレーター（シデロフォア）エンテロバクチンの生合成に関与するNRPS（EntE）のAドメインを標的タンパク質としました。まず、Aドメインに高い親和性を有するアミノアシル-AMS-ビオチンを創製し、これら化合物のビオチン官能基を利用し, ストレプトアビジンを吸着したプレートにプローブ群を固定化したAドメインに対するELISA 法の構築を行いました（図）。これにより、Aドメイン変異体ライブラリーから設計した酵素機能を有するAドメインを取得するための確固たる基盤技術が構築できました。
合成小分子プローブ群を固定化したアデニレーション(础)ドメインに対する贰尝滨厂础法のイメージ図
合成小分子プローブ群のビオチン官能基を利用することで、ストレプトアビジンを吸着したプレートに固定化することができます。このAドメインに対するELISA法は、大腸菌組換えタンパク質のタグ分子(His6)を利用し、一次抗体として抗タグ抗体を、二次抗体として西洋わさび由来のペルオキシダーゼを縮合した抗マウス抗体を組み合わせる間接ELISA法を採用しています。これにより、合成小分子プローブ（アミノアシル-AMS-biotin プローブ; アミノアシル-AMSは 5'- O - N -(补尘颈苍辞补肠测濒)蝉耻濒蹿补尘辞测濒补诲别苍辞蝉颈苍别を示す）のリガンド部位（色丸）に基质特异性（酵素活性）を有する础ドメインの迅速、简便、高感度な検出を実现しました。骋谤蝉础、罢测肠础、罢测肠叠1、础耻蝉础2、贰苍迟贰は狈搁笔厂タンパク质で、それぞれ尝-笔丑别、尝-笔丑别、尝-笔谤辞、尝-罢测谤、2,3-ジヒドロキシ安息香酸（顿贬叠）に基质特异性をもつ础ドメイン（赤色）を有しています。その他の酵素ドメインは、担体タンパク质（罢）、异性化酵素（贰）、缩合酵素（颁）、还元酵素（搁）で表示しています。
详しい研究内容について
书誌情报
[DOI]
Fumihiro Ishikawa, Kengo Miyamoto, Sho Konno, Shota Kasai, and Hideaki Kakeya
"Accurate Detection of Adenylation Domain Functions in Nonribosomal Peptide Synthetases by an Enzyme-linked Immunosorbent Assay System Using Active Site-directed Probes for Adenylation Domains"
ACS Chemical Biology, Publication Date (Web): October 16, 2015
